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M-MLV(重組型逆轉錄酶)(R1041-R1042)

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R1041( 25次) R1042( 50次)

M-MLV 逆轉錄酶

產品說明

M-MLV逆轉錄酶是由一個 71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉錄聚合酶??梢源呋?/span>RNADNARNA雜交鏈為模板的互補DNA 的聚合反應。本酶經修飾RNase H活性比普通的逆轉錄酶要弱很多,因此在合成第一鏈cDNA的過程中,可保證RNA的降解程度較低,從而使得率提高。

 

產品組分

組分

R1041

R1042

M-MLV (200U/μl)

5000U/25 μl

10000U/50 μl

first-strand buffer

100 μl

200 μl

R1041可進行25次逆轉錄反應,R1042可進行50次逆轉錄反應(20 μl 標準 PCR 反應體系,每次使用 M-MLV 1 μl)。

M-MLV 儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5),200 mM NaCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,0.01% NP-40,50% glycerol

5x first-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃),375 mM KCl,15 mM MgCl2,50 mM DTT

 

保存條件

-20℃保存,避免反復凍融。

 

質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作為標記,200 UM-MLV1μg、1.2 kbRNA為模板進行逆轉錄反應,最低可得到120 ngcDNA,所得cDNA長度 > 全長的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50 ng的標記DNARNA200 U M-MLV反應緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,檢測DNARNA降解都不到總量的1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超螺旋質粒DNA500 U M-MLV反應緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,瓊脂糖電泳檢測,無明顯的剪切。

 

適用范圍

第一鏈cDNA 合成;cDNA 文庫構建;RT-PCR;引物延伸;3' 5' RACE。

 

注意事項

l  成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長的完整性并且不含逆轉錄酶的抑制劑,如EDTA SDS。用于cDNA合成反應的溶液試劑盡可能用DEPC進行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時,首先用經過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進行過濾除菌處理。

l  為了增加貯存RNA樣品的穩定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2 M同時加入4倍體積的乙醇,室溫放置3-5 min,10,000 rpm離心5 min。

l  在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑(RNasin)以增加cDNA合成的長度和產量。在第一鏈合成反應中,RNase抑制劑在緩沖液和還原劑(如 DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A,B,C RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了RNase抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。

l  較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開,增加反應的產量。

l  使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應的RNA,但為了保證實驗的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備的高純度RNA。

l  為防止RNA降解,應盡量避免反復凍融,最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反應條件,因PCR擴增儀的不同而不同,所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應,以確定最佳的PCR反應條件。

l  cDNA產物應置于-20℃保存。

l  當以cDNA為模板進行PCR之前,使用RNase H處理cDNA,可以提高PCR反應的靈敏度。

 

操作步驟

1 在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

 RNA

1-5 μg

Oligo (dT)15 Random primer

1 μl

RNase-free ddH2O

To 13.4 μl


2
進行變性退火反應

70℃溫浴5 min,簡短離心后冰浴5 min。

3 在上述離心管中配制反轉錄反應液

 上述反應液

13.4 μl

5× first-strand buffer

4 μl

dNTPs10 mM

1 μl

RNasin

0.6 μl

M-MLV

1 μl

Total

20 μl


4
按下列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)15 42℃溫浴60 min;

Random primer 37℃溫浴60 min。

5 終止反應

70℃溫浴5 min終止反應,置冰上進行后續實驗或-20℃保存。

6 RNase-free ddH2O將反應體系稀釋到50μl,取2-5μl進行PCR擴增反應。

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